复方曲肽注射液通过抑制氧化应激和促进血管生成从而对大鼠脑缺血具有保护作用
WENBINGMA1,SHIXIANGWANG2,XUANLINLIU1,FENGRUTANG1,PEIPEIZHAO1,KAICHENG1,QIAOWEIZHENG1,YINGCHENZHUO1,XUEZHAO1,XUEQIANLI1andWEIYIFENG1
1西安医院药剂科，陕西西安；
2教育部中国西部资源生物学与生物技术重点实验室/西北大学生命科学学院，陕西西安，中国
年8月2日收到;年1月25日接收
DOI:10./mmr..
摘要：
脑缺血，包括脑组织缺血和脑血管缺血，导致氧气供应不足或脑缺氧，并导致脑组织死亡或脑梗死/缺血性卒中。为改善缺血性脑组织的血液供应，并在临床实践中增强神经保护作用，曲复方曲肽注射液（TCHI）在中国被广泛应用。但是，TCHI在脑血管疾病中的获益和详尽的作用机制，还需要进一步研究。因此，在本研究中，采用体内和体外实验模型研究TCHI在脑缺血性损伤中的潜在机制。结果表明，TCHI增加了脑组织匀浆中的乳酸脱氢酶水平、降低了乳酸水平。进一步观察到，TCHI可显着提高缺血性脑组织的超氧化物歧化酶活性并降低丙二醛在缺血脑组织中的水平。此外，TCHI显著地诱导了血管成熟，包括培养的人脐静脉内皮细胞的增殖、粘附、迁移和管路形成。此外，TCHI显著地刺激了大鼠主动脉环和鸡胚绒毛尿囊膜实验中的微血管形成。综上，这些结果提供了有力的证据，证明TCHI在多个步骤上刺激了血管生成，并表明TCHI通过改善氧化应激和促进血管生成来减轻脑缺血损伤。
关键词：
曲克芦丁，脑蛋白水解物，脑缺血，氧化应激，血管生成
Abstract:
Brainischemia,includingcerebralischemiaandcerebrovascularischemia,leadstopooroxygensupplyorcerebralhypoxia,andcausesbraintissuedeathorcerebralinfarction/ischemicstroke.Thetroxerutinandcerebroproteinhydrolysateinjection(TCHI),iswidelyappliedinChinatoimprovebloodsupplyinischemicbraintissuesandtoenhanceneuroprotectiveeffectsinclinicalpractice.However,thebenefitsanddetailedunderlyingmechanismelaboratingtheeffectivenessofTCHIincerebrovasculardiseasesrequirefurtherinvestigation.Therefore,inthepresentstudy,experimentalinvivoandinvitromodelswereemployedtoinvestigatethepotentialmechanismsofTCHIoncerebralischemicinjury.TheresultsdemonstratedthatTCHIincreasedthelactatedehydrogenaselevelsinthebrainhomogenateandconverselydecreasedlacticacidlevels.TCHIwasfurtherobservedtosignificantlyincreasesuperoxidedismutaseactivityanddecreasemalondialdehydelevelsinischemicbraintissues.Inaddition,TCHIsignificantlyinducedvascularmaturationprocesses,includingproliferation,adhesion,migrationandtubeformationinculturedhumanumbilicalveinendothelialcells.Additionally,TCHIsignificantlystimulatedmicrovesselformationintherataorticringandchickchorioallantoicmembraneassays.Takentogether,theseresultsprovidedstrongevidencethatTCHIstimulatedangiogenesisatmultiplesteps,andindicatedthatTCHIattenuatedcerebralischemicdamagethroughtheameliorationofoxidativestressandpromotionofangiogenesis.
引言
大脑（brain）缺血，也称为脑（cerebral）缺血或缺血性卒中，是指脑血流量不足以满足代谢需求，是全球范围内导致死亡的主要原因，并导致严重的长期残疾（1,2）。脑缺血，特别是急性缺血性卒中的治疗策略目前包括溶栓、抗血小板凝集和神经保护疗法，其中溶栓仍然是唯一有效的治疗方法。然而，缺乏有效的治疗来改善脑缺血后的功能性恢复，而缺血性卒中的治疗被限制在狭窄时间窗并具有出血风险（3）。因此，脑缺血的机制和卒中后患者的治疗仍在研究中（2）。
以过度产生活性氧（ROS）为特征的氧化应激是公认的脑缺血损伤的机制（4,5）。于是，抗氧化剂被认为是治疗脑缺血损伤的常规治疗策略。超氧化物歧化酶（SOD）是针对ROS和超氧化物阴离子的特异性清除剂的第一线内源防御，它消除了氧自由基以防止过度的超氧化物阴离子损害，并且在维持身体正常生理活动中起重要作用。此外，作为由氧自由基诱导的脂质过氧化的产物，组织中的丙二醛（MDA）含量有效地反映了细胞损伤程度和自由基攻击人体的程度（6）。许多研究证实，脑缺血后脑组织中的SOD、乳酸脱氢酶（LDH）和MDA水平是异常的（7,8）。此外，最近的研究表明，促进血管生成和从现有血管形成新血管可能是减少缺血性卒中后梗死体积和促进神经行为康复的新策略（2,9）。增强内皮细胞的功能，包括粘附、迁移、增殖和分化，在血管生成过程中对诱导新生血管为缺血组织提供所需的营养、氧气和血流是至关重要的。
曲克芦丁是一种黄酮醇，被用做血管保护剂和抗氧化剂；脑蛋白（cerebroprotein）水解物包括大脑蛋白（brainprotein）水解物和唾液酸。复方曲肽注射液（TCHI）已获中国国家食品药品监督管理局批准，基于其神经保护效果，可在临床中减轻脑缺血严重程度（10）。曲克芦丁具有降低血液粘度、抑制血小板聚集、促进侧支循环形成、改善微循环和消除自由基的作用，并可以进一步有效地抑制血栓形成并促进受损神经组织的修复（11）。Bayer等人（12）证明唾液酸会促进血管的形成。其他研究表明，唾液酸与细胞外基质（ECM）成分和生长因子相互作用，调节细胞粘附、迁移和增殖（13）。内皮细胞表达多种整合素异二聚体，包括αvβ3、α5β1和αvβ5。其中，整合素β3是血管生成中的关键细胞粘附分子（14）。表达在内皮细胞表面的整合素β3激活并促进内皮细胞增殖，从而促进血管生成（15）。此前的一项临床研究表明，TCHI可促进急性脑梗死患者的神经功能康复（16）。TCHI可缩短昏迷持续时间、改善质量生活和长期预后，进一步证明了临床研究的结论（17）。因此，（我们）推测TCHI通过减轻氧化应激或促进血管生成来减轻脑缺血损伤。然而，TCHI在脑血管疾病中发挥作用的详细机制尚需进一步研究。
在本研究中，采用体外和体内实验模型来研究TCHI保护脑组织避免受到缺血性损伤的潜在机制。
材料和方法
药物
TCHI（药品批号；山东省步长药业有限公司，中国菏泽）是一种用无菌水、曲克芦丁（C33H42O19）和猪脑提取物制成的复合制剂。TCHI的成分包括曲克芦丁（40mg/ml）、活性肽、多种氨基酸和多种神经节苷脂（μg/ml），总氮含量为0.5mg/ml。依达拉奉（药品批号；南京先声东元制药有限公司，中国南京）是一种神经保护药物，具有自由基清除剂的特性，具有减轻氧化应激的潜在能力，被用于帮助卒中后功能恢复和治疗肌萎缩性侧索硬化症。
动物
从西安交通大学实验动物中心（中国西安）购买雄性SD大鼠（n=66，±20g，6-8周龄），并饲养在12小时光照-黑暗循环的房间内，温度保持在22±2℃，相对湿度为60±2％。所有大鼠可随意获取食物和水。所有动物研究均根据《实验动物的护理和使用指南》进行，并经西安交通大学医学院伦理委员会批准（中国西安）
大脑中动脉闭塞（MCAO）
如先前所述，MCAO的改良模型被用于实现永久性局灶性缺血（18,19）。简而言之，通过腹膜内注射7％水合氯醛（mg/kg）来麻醉动物，暴露并分离出右侧颈总动脉。通过将单丝尼龙缝线（直径0.mm）插入颈内动脉，可闭塞大脑中动脉（MCA）。当遇到阻力时停止插入，并计算缺血时间。插入的尼龙线的长度为18-20毫米。缝合伤口，并密切监测大鼠的术后恢复情况。
分组和给药
本研究包括六组大鼠（每组11只大鼠），分组如下：假手术组（大鼠均与模型组进行相同的手术，除了不插入尼龙缝线以外）；MCAO模型组（大鼠存在缺血）；三个TCHI组（其中动物在MCAO后分别接受0.5、1.0和2.0ml/kgTCHI。该药物在小鼠中代谢，并且描述了每种剂量下的浓度，而不是三种剂量的总浓度，因为该描述更类似于MCAO之后的人类用药方案）；阳性对照组，MCAO后大鼠接受依达拉奉（5mg/kg）治疗。依达拉奉是一种合成的抗氧化剂，可以中和自由基，可用于缓解与脑缺血和氧化有关的再灌注损伤（20）。术后、术后6小时和术后24小时，分别给予TCHI和依达拉奉3次。假手术组和MCAO模型组，在手术后、术后6小时和术后24小时，分别给予生理盐水。
神经功能评估
在术后6小时和术后24小时仔细评估每只大鼠的动物行为。对动物的神经系统损伤评分如下：0，正常自发运动；1，未能充分伸展对侧前爪；2，向患侧盘旋；3，患侧部分偏瘫；4，没有自发运动。
脑梗死范围的测定
最后一次给药后2小时，将大脑小心取出，切成6个冠状切片，厚度为2毫米。接下来，将切片在37℃的温度下迅速用三苯基氯化四唑（TTC；Sigma-Aldrich；MerckKGaA，Darmstadt，德国）溶液染色30分钟，然后用10%的缓冲多聚甲醛孵育，以便固定。染色后，非缺血性组织被染成红色，而梗死区域则呈白色。小心地将白色组织剥离并称重。将脑梗死范围计算为梗死组织重量占缺血半球重量的百分比。
脑组织中的乳酸（LD）、LDH、SOD和MDA水平的测定
称重手术侧的大鼠脑组织，用生理盐水制备10％的脑匀浆，并保存在-20℃的冰箱中。将匀浆液在4℃以xg离心10分钟，取上清液，按照制造商的说明进行操作，在其各自的活性测定试剂盒的96孔板中测量LH、MDA、SOD和MDA活性（cat.nos.A、A、A-3和A-1；南京建城生物工程研究所，南京）。蛋白质含量则通过缩二脲法测量，如前所述（21）。
MTT测定
人脐静脉内皮细胞（HUVECs）由中国科学院典型培养物保藏中心（中国上海）提供。RPMI培养基购自Gibco；赛默飞世尔科技有限公司（美国，马萨诸塞州，沃尔瑟姆）。胎牛血清购自浙江天航生物技术有限公司（中国杭州）。将HUVEC接种到96孔板中（3x细胞/ml），并在5％CO2的高湿气体中、温度37℃培养24小时。随后，将培养基替换为μl含各种浓度TCHI（0、2、10、50和μg/ml）的含药培养基。孵育24小时后，用μl无血清培养基和20μlMTT代替药物培养基，于37℃下温育4小时。弃去上清液，加入μlDMSO溶解沉淀物。使用振荡器15分钟，将孔中的内容物溶解，并使用酶标仪在nm波长处测量吸光度。
管路形成测定
用μlMatrigel（BD生物科技，富兰克林湖，新泽西州，美国）包被48孔板，并在37℃下孵育30分钟使其固化。将HUVEC（μlRPMI培养基，2×细胞/孔）和不同浓度的TCHI（0、2、10、50和μg/ml）添加到平板中。孵育24小时后，通过显微镜观察管路的形成，并拍摄细胞的照片。
粘附测定
HUVEC置于RPMI培养基中培养，在5％CO2的高度湿润的气体下，37℃培养24小时。该培养基（RPMI培养基）添加了10％的胎牛血清、μg/ml链霉素和IU/ml含有0、2、10、50和μg/mlTCHI的青霉素。孵育24小时后，将HUVEC（2×个细胞/孔）接种在涂有Matrigel的24孔板上孵育1小时。丢弃培养基后，将板用PBS洗涤3次并在显微镜下观察，然后拍照检测细胞粘附。
细胞迁移测定
将HUVEC（2.5×/孔）接种在6孔细胞培养板中，然后在5％CO2气体中，温度37℃孵育24小时。当HUVEC铺满平板的90％时，用μl移液器吸头刮擦板上的单层HUVEC，并用PBS洗涤3次。然后加入含有各种浓度的TCHI（0、2、10、50和μg/ml）的新鲜培养基。在37℃下孵育0、12和24小时后，分别获得平板照片以检测细胞迁移。
鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）测定
用1％的苯扎溴铵清洗受精的鸡蛋（西安新丰源畜牧专业合作社，西安），然后置于相对湿度60-70％的培养箱中，于温度37℃下孵育7天。孵育的第8天，在鸡蛋的较宽的一侧小心制作一个直径为1厘米的窗口，然后在无菌的明胶海绵中浸入生理盐水（作为对照）。将10μg/mlTCHI或重组牛碱性成纤维细胞生长因子（bFGF；4IU/ml；珠海市亿生生物制药有限公司，中国广东）放置在卵内，并立即将渗透性胶带贴在窗口上。bFGF是在血管生成中起基本作用的细胞因子，在CAM分析中用作阳性对照药物。孵育3天后，在室温下将CAM与4％多聚甲醛固定10分钟。拍摄明胶海绵周围血管的照片，并在显微镜下计数这些血管的数量。
大鼠主动脉环测定
在大鼠主动脉环测定中使用的雄性SD大鼠（n=2，±20g，6-8周龄）购买自西安交通大学实验动物中心（中国西安），饲养在12小时明暗循环、温度22±2℃、相对湿度60±2％的房间。大鼠可自由获得食物和水。然后，在4℃下用μlMatrigel覆盖48孔板，并在37℃、5％CO2中孵育30分钟。用20％氨基甲酸酯麻醉大鼠，然后分离其主动脉并清除管腔中残留的血液和多余的脂肪组织。将主动脉切成1毫米长的环，放置在覆盖有Matrigel的平板孔上，并额外用μlMatrigel覆盖。动脉环在RPMI完全培养基中培养，或在含有2、10、50或μg/mlTCHI的培养基中培养。孵育6天和9天后，在倒置显微镜下测量微血管的生长并拍摄动脉环的照片。
RT?PCR
根据制造商（提供）的实验步骤，使用RNAfast0试剂盒（Fastagen，中国上海）分离总RNA。随后根据制造商（提供）试验步骤，使用PrimeScriptRTMasterMixPerfectReal-Time试剂盒（DRRA；TakaraBio，Inc.，Otsu，Japan）将RNA反转录为cDNA。使用的引物序列（桑贡生物技术有限公司，中国上海）为：β3，正向5-GCCAGCACCATCTCTTTAAG-3和反向5-GCACTCTCTCTCCCTTTGAGGA-3，长度为bp；β-肌动蛋白，长度为bp的正向5-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3和反向5-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3。PCR的循环方案包括以下步骤：将样品在94℃下孵育2分钟，然后在94℃下变性35个循环，持续30秒，在55℃下退火30秒，然后在72℃下延伸30秒，最后一个周期在72℃下孵育2分钟。扩增产物在琼脂糖凝胶中通过电泳（北京均义，中国北京）进行分析，并在用核酸染料（DuRed；凡博生物化学，中国北京）染色后在紫外光下（Bio-RadLaboratories，Inc.，赫拉克勒斯，加利福尼亚州，美国）进行检测。使用定量分析系统（QuantityOne分析软件，版本4.6.2；Bio-RadLaboratories，Inc.）分析图像。
统计分析
数据表达为平均值±标准差。使用SPSS17.0版软件（SPSS，Inc.，芝加哥，伊利诺伊州，美国）进行统计分析。使用单因素方差分析比较组之间的差异，P0.05表示统计学上的显著性差异。
结果
TCHI可改善大鼠脑缺血损伤后的神经功能，并减少梗死面积
首先，为了检查TCHI在MCAO动物模型中的保护作用，尾静脉注射TCHI（0.5、1和2ml/kg）、依达拉奉（5mg/kg）或媒介物，并在MCAO手术后0、6和24小时进行了神经功能缺损评分。结果表明，假手术组未出现神经功能缺损，而其他组在MCAO手术后6和24h出现了不同程度的神经功能缺损症状（图1A和B）。此外，在手术后6h，TCHI剂量组（0.5、1和2ml/kg）与MCAO模型组之间的神经功能缺损评分无显着差异（2.80±0.42、2.80±0.42和2.70±0.48vs2.90±0.32；图1A）；与MCAO模型组和TCHI组相比，依达拉奉组显著降低了术后6h的神经功能缺损评分（分别为2.90±0.32、2.80±0.42、2.80±0.42和2.70±0.48比2.10±0.88；P0.05；图1A）。然而，与MCAO模型组相比，依达拉奉组和2ml/kgTCHI组的神经功能缺损评分在术后24小时显著降低（分别为2.50±0.53和1.70±0.48、1.70±0.67；P0.05；图1B）。与MCAO模型组相比，0.5和1ml/kgTCHI组、依达拉奉组在术后24h的神经功能缺损评分显著降低（分别为2.50±0.53、2.70±0.67、2.36±0.67比1.70±0.48；P0.05；图1A）。术后24小时，2ml/kg的TCHI组和依达拉奉组的神经功能缺损评分未见显著差异（1.70±0.67比1.70±0.48；图1A）。随后，使用TTC染色确定脑梗死体积。与假手术组相比，模型组梗死体积明显增加（P0.01；图1C和D），MCAO模型组大鼠的脑梗死体积为45.35±6.75％，以1和2ml/kgTCHI治疗的大鼠脑梗死体积分别为32.78±7.86%、33.66±3.19％，以5mg/kg依达拉奉治疗的大鼠脑梗死体积为10.59±4.40％。因此，本研究的结果表明，与未治疗的模型组相比，用1ml/kgTCHI、2ml/kgTCHI、5mg/kg依达拉奉治疗的MCAO大鼠中，脑梗死体积的百分比显着降低（P0.01；图1C和D）。此外，与依达拉奉组相比，依达拉奉组的脑梗死体积百分比明显高于TCHI组（P0.01；图1C和D）。
图1.TCHI对MCAO大鼠神经系统评分和梗死体积的影响。显示MCAO后（A）6h和（B）24h的神经系统评分。（C）用氯化三苯四唑染色的缺血大鼠脑冠状切片。（D）在MCAO的大鼠中，TCHI治疗后脑梗死面积减少。数据表示为平均值±平均值的标准误（n=10-11/组）。**P0.01，比假手术组；#P0.05、##P0.01比MCAO组;与▲P0.05和▲▲P0.01比依达拉奉组。TCHI，复方曲肽注射液；MCAO，大脑中动脉闭塞。
TCHI可防止氧化损伤
为了研究潜在的抗氧化机制，测定了SOD活性。SOD是防御氧化应激最重要的内源性抗氧化酶之一。结果表明，与假手术组相比，MCAO术后24hSOD活性明显降低（P0.01）。与MCAO模型组相比，给予1ml/kgTCHI、2ml/kgTCHI和5ml/kg依达拉奉后SOD活性显着增加（8.97±0.82、9.03±0.95和9.40±0.89比6.74±0.61U/mg；P0.01；图2A）。1ml/kgTCHI、2ml/kgTCHI组与依达拉奉组之间未观察到SOD活性的显著差异。在MCAO手术后24小时测定脑组织中的MDA水平。结果表明，与假手术组相比，MCAO组的MDA水平显着增加（1.64±0.14比0.99±0.10nM/mg;P0.01）。与MCAO模型组相比，TCHI和依达拉奉治疗组显著降低了MDA水平（分别为1.33±0.26、1.26±0.14、1.03±0.08、1.05±0.12比1.64±0.14nM/mg;P0.01;图2B）。此外，依达拉奉组的MDA水平显著低于0.5mg/kgTCHI组和1mg/kgTCHI组。2ml/kgTCHI组和依达拉奉组之间MDA水平没有显著性差异。这些结果表明，TCHI是一种有效的抗氧化剂，可减轻脑缺血损伤。
TCHI降低MCAO大鼠脑组织中的LDH和LD水平
在大鼠脑组织中检测LDH和LD的水平。结果表明，与模型组相比，TCHI治疗组（1ml/kg和2ml/kg）和依达拉奉组的LD水平显著降低（分别为0.39±0.04、0.41±0.05、0.34±0.04比0.53±0.05mM/g；P0.01；图2C）。与依达拉奉组相比，TCHI组的LD水平显著升高（分别为0.51±0.05、0.39±0.04、0.41±0.05比0.34±0.04mM/g；图2C）。此外，在1ml/kgTCHI、2ml/kgTCHI和5mg/kg依达拉奉剂量下，LDH水平与模型组相比显著升高（分别为.59±12.88、.71±19.37、.34±28.09比.69±19.63U/g；P0.01；图2D）。与依达拉奉组相比，0.5mg/kgTCHI组的LDH水平显著降低（.20±12.50比.34±28.09，P0.01；图2D），尽管在1ml/kgTCHI和2ml/kgTCHI组的LDH水平与依达拉奉组相比没有显著性差异。上述结果表明，TCHI对纠正大脑酸中毒具有重要作用。
图2.MCAO后，TCHI对SOD、MDA、LD和LDH水平的影响。MCAO后24小时的（A）SOD、（B）MDA、（C）LD和（D）LDH的水平示意图。数据表示为平均值±平均值的标准误（n=10-11/组）。**P0.01，比假手术组；##P0.01，比MCAO组；▲P0.05和▲▲P0.01，比依达拉奉组。TCHI，复方曲肽注射液；SOD，超氧化物歧化酶；MDA，丙二醛；LD，乳酸；LDH，乳酸脱氢酶；MCAO，大脑中动脉闭塞。
TCHI可促进HUVEC增殖和管路形成
TCHI对内皮细胞的增殖作用通过MTT测定。此前有报道称曲妥菌素在浓度为0.-10μg/ml的情况下可增强胸腺细胞的活力并减少细胞凋亡，当使用10μg/ml的剂量时，效果最佳（22）。在本研究中，给予HUVEC浓度为2-μg/ml的TCHI。与对照组相比，用TCHI（2、10和50μg/ml）处理后可显著增强HUVEC的增殖（分别为0.76±0.13、0.80±0.08、0.79±0.14比0.63±0.09；P值分别为P0.05，P0.01和P0.05），而μg/ml的TCHI对细胞增殖没有显著影响（图3A）。此外，基于Matrigel的体外试验研究了TCHI对HUVEC管路形成的影响。结果显示，与对照组相比，TCHI（10、50和μg/ml）显著刺激了肾小管形成（分别为19.5±2.65、17.5±2.08、11.5±2.65比4.50±1.29；P0.01；图3B和C）。这些结果表明在血管生成过程中TCHI对HUVEC有促进作用。
图3.TCHI对人脐静脉内皮细胞增殖和管路形成的影响。（A）通过MTT试验评估暴露在2、10、50或μg/ml的TCHI下24小时后的细胞增殖。在Matrigel上培养并在含有2、10、50或μg/mlTCHI的培养基中37℃下孵育的细胞的毛细管型管形成的（B）定量和（C）细胞图像（放大倍数，x）。数据表示为平均值±平均值的标准误。*P0.05、**P0.01和***P0.，比对照组。TCHI，复方曲肽注射液；MTT，甲基噻唑基二苯基溴化四唑；OD，光密度。
TCHI可增加HUVEC的粘附和迁移
内皮细胞的粘附和迁移能力对于血管发育和血管生成至关重要。为了进一步研究TCHI的促血管生成活性，进行了内皮细胞粘附试验。如图4A和B所示，除了μg/mlTCHI外，与对照组相比，2、10和50μg/mlTCHI处理后显著增强了HUVEC的粘附性（分别为.78±2.47，.50±1.52、.81±4.85比.07±3.73；P0.05或P0.01）。此外，使用刮擦试验在0、12和24小时观察伤口闭合和细胞迁移期间的平均迁移距离。结果表明，与对照组相比，在媒介物处理的对照组中观察到了低水平的HUVEC迁移，而TCHI（2、10、50和μg/ml）极大地促进了HUVEC迁移（51.00±6.08、59.63±1.10、48.87±1.90、44.10±0.53％比21.80±0.10％；P0.01；图4C和D）。
图4.TCHI对HUVEC粘附和迁移的影响。（A）将HUVEC暴露于浓度为2、10、50或μg/ml的TCHI中24小时，接种在Matrigel涂层的24孔板上，孵育1h，并在显微镜下观察。TCHI处理后HUVEC的（B）粘附和（C）迁移显着增强。（D）通过伤口愈合试验测定细胞迁移，在此过程中，将单层HUVEC用μl移液管损伤，然后用TCHI（2、10、50或μg/ml）处理。在0、12和24小时，用数码相机观察伤口愈合情况。*P0.05和**P0.01，比对照组。TCHI，复方曲肽注射液；HUVEC，人脐静脉内皮细胞。
TCHI在CAM试验中促进血管生成
CAM模型被用来明确TCHI在血管生成中的作用。如图5A和B所示，与未治疗的对照组相比，分别暴露于5ng/mlbFGF或10ng/mlTCHI3天后，血管密度分别显着增加了55.32％和46.81％（14.60±3.50、13.80±3.19比9.40±2.37；P0.01；图5A和B）表明TCHI在血管生成中对CAM有积极作用。
图5.（A）TCHI在CAM模型中促进了血管生成。（B）暴露于5ng/mlbFGF或10ng/mlTCHI后，血管密度显著增加。**P＜0.01，比对照组。TCHI，复方曲肽注射液；CAM，鸡胚绒毛尿囊膜；bFGF，重组牛碱性成纤维细胞生长因子。
TCHI促进了大鼠主动脉环的微血管外生
在体外，大鼠主动脉环模型用于检测TCHI诱导的血管生成。结果表明，在治疗6天后，TCHI（2、10、50和μg/ml）显著刺激了培养的主动脉环外膜的微血管出芽，分别占对照组的.84%、.54%、.77%和.54％，分别为13.25±4.50、23.50±4.73、21.50±1.73和17.00±2.94比6.50±1.73；P0.05或P0.01；图6A和B）。治疗9天后，用2、10、50和μg/mlTCHI处理的大鼠中的微血管数量分别增加了37.23%、.67%、.42%和.88％，与对照组相比数值分别为82.50±9.57、91.25±19.31、97.50±17.08和47.00±9.06比34.25±4.92;P0.05或P0.01；图6。
图6.（A）治疗6天和9天后，TCHI促进了主动脉环出芽。（B）在大鼠主动脉环模型中检测到微血管数量增加。*P0.05、**P0.01，比对照组。TCHI，复方曲肽注射液。
TCHI在增强HUVEC上整合素β3在体外的表达
随后，为了进一步研究TCHI对内皮细胞的作用，检测了整合素β3mRNA的表达。如前所述，结果表明10μg/mlTCHI对内皮细胞功能（包括粘附、迁移和毛细血管形成）表现出最强的药理作用。用10μg/mlTCHI处理HUVEC48小时后，用RT-qPCR方法研究了整合素β3mRNA的转录表达。10μg/mlTCHI组与对照组相比，整合素β3mRNA水平显著增加（1.34±0.08比1.16±0.09；P0.01；图7A和B）。结果提示TCHI可以促进整合素β3在内皮细胞中的表达，增强内皮细胞的粘附功能，从而促进血管生成。
图7.TCHI促进了人脐静脉内皮细胞上整合素β3mRNA的表达。用TCHI处理24小时的细胞中，（A）整合素β3的逆转录-定量聚合酶链反应测定结果和（B）定量的整合素β3的mRNA表达结果。TCHI诱导整合素β3mRNA的表达显著增加。数据表示为平均值±平均值的标准误。**P＜0.01，比对照组。TCHI，复方曲肽注射液。
讨论
在临床实践中，已观察到复方曲肽注射液对急性脑梗死具有保护效果（16）。但是，作用机理仍不清楚。本研究表明，在大鼠MCAO模型中，TCHI可有效减轻的神经系统症状和脑缺血损伤。此外，结果表明TCHI治疗脑缺血的获益伴随着LDH和SOD活性的增加以及LD和MDA水平的降低。此外，在体内观察到TCHI促进血管生成，在体外观察到RCHI增强内皮细胞功能。
脑缺血和组织缺氧后，厌氧代谢导致乳酸和质子的产生（23）。乳酸的堆积会导致脑水肿、血脑屏障功能障碍和自由基产生，可通过抑制兴奋性氨基酸的摄取促进组织坏死（24）。LDH是参与能量代谢的关键酶，该酶通过脱氢作用将乳酸转化为丙酮酸（25）。本研究的结果表明，严重的脑损伤会导致较高的神经功能缺损评分和较低的LDH水平。TCHI治疗增加了脑匀浆中LDH的水平，反之则降低了LD水平，表明TCHI减弱了缺血性坏死的程度并增加了正常脑细胞的数量。
脑缺血后自由基和ROS越来越多地产生，氧化应激被认为是脑缺血后脑损伤的基本机制（26,27）。ROS水平受内源性抗氧化酶调节，包括SOD和谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）。SOD的抗氧化活性间接反映了清除ROS的能力。MDA是脂质过氧化作用的终产物，其水平反映了自由基导致的损伤的程度（28）。研究表明曲克芦丁可显著地降低了MDA水平并增加了GPx活性（29）。在本研究中，在缺血性脑损伤后，TCHI显著地增加了SOD活性并降低了MDA水平，表明TCHI通过减弱氧化应激从而减轻了脑缺血性损伤。但是，详细的机制仍需要进一步研究。
此前已证实，脑缺血后微血管密度会增加。缺血后的血管生成可改善脑卒中患者的脑血流灌注、神经功能恢复和生存率（30）。因此，增强脑血运重建是治疗脑缺血的重要方法。血管生成由一系列事件组成，包括内皮细胞增殖、迁移、粘附和管形成（31）。在本研究明确了TCHI对内皮细胞功能的影响，结果表明TCHI在培养的HUVEC中显著地促进了血管成熟过程，包括细胞增殖、粘附、迁移和管路形成。进一步表明TCHI可在体外显著刺激大鼠主动脉环中的微血管形成。细胞-基质相互作用对于细胞迁移至关重要，并且已经发现特定的ECM蛋白可调节内皮细胞的迁移（32）。本研究中的刮擦试验结果表明，TCHI治疗以剂量依赖的方式促进了内皮细胞的迁移。这些结果提供了有力的证据，证明TCHI在内皮细胞增殖、迁移、粘附和管路形成上激发了血管生成。
本结果进一步表明TCHI刺激了整合素β3mRNA在内皮细胞中的转录。一项较早的研究认为，内皮细胞特异的整合素β3与血管内皮生长因子之间的协同相互作用在血管生成中起关键作用（33）。因此，本研究进一步研究了TCHI促进血管生成的详细机制。本研究的管路形成试验和主动脉环试验结果表明，TCHI通过管路形成促进了血管生成。这些结果在CAM模型中得到验证，TCHI增加了血管密度和血管分支。总之，这些发现表明TCHI通过增强内皮细胞迁移并诱导血管网络的形成来促进血管生成。
然而，本研究的局限性在于没能在体内检测脑缺血与血管生成之间的关联。这是由于脑缺血和血管生成动物模型的复杂性导致的，与急性动物模型相比，需要长得多时间才能表现出明显的变化（34）。此外，我们已经尝试建立动物模型，但是很难从模型组中获得稳定的结果；于是，这些体内实验由于技术原因而被延迟，因此在本研究中未进行体内实验。目前（我们）正在研究（如何）建立可靠的动物模型。
总而言之，本研究发现TCHI可提高脑缺血大鼠的LDH水平和LD水平。在大鼠脑组织缺血后，TCHI还显著增加了SOD活性并降低了MDA水平。此外，TCHI通过增加增殖和增强内皮细胞的功能（包括粘附、迁移和毛细血管形成）来促进血管生成。因此，TCHI通过改善氧化应激和血管生成减少了实验性缺血性损伤（图8）。这些数据初步阐明了TCHI在改善脑缺血再灌注损伤中的作用，并为临床实践中合理使用TCHI提供了理论依据。
图8.用以阐明TCHI对卒中后神经功能的保护的作用机理。TCHI，复方曲肽注射液；ROS，活性氧；SOD，超氧化物歧化酶；MDA，丙二醛；LD，乳酸；LDH，乳酸脱氢酶。
致谢
不适用。
资金来源
本研究得到了中国自然科学基金（批准号和）、西安医院基础研究基金（批准号MS?04）和西安医院临床研究奖的资助（批准号XJTU1AF?CRF??）。
数据和资料的获取
基于合理的请求，当前研究中使用和/或分析的数据集可从通讯作者处获得。
作者的贡献
WF、SW和WM设计了实验。WM、XLui、FT、PZ、KC和XLi进行了实验。QZ、YZ和XZ分析了数据。WF和WM撰写了手稿。WF和XLi修改了手稿。所有作者均审阅了最终稿。
伦理审批
所有动物研究均按照《实验动物的护理和使用指南》进行，并得到西安交通大学医学院（中国西安）伦理委员会的批准。
病人对于发表的知情同意
不适用。
利益冲突
作者称他们没有利益冲突。
引用文献
1.WritingGroupMembers,Lloyd-JonesD,AdamsRJ,BrownTM,CarnethonM,DaiS,DeSimoneG,FergusonTB,FordE,FurieK,etal:Heartdiseaseandstrokestatistics-update:AreportfromtheAmericanHeartAssociation.Circulation:e46-e,.
2.SoleimannejadK,RahmaniA,HatefM,KhataminiaM,HafeziAhmadiMRandAsadollahiK:Effectsofnigellasativaextractonmarkersofcerebralangiogenesisafterglobalischemiaofbraininrats.JStrokeCerebrovascDis26:-,.
3.Gursoy-OzdemirY,YemisciMandDalkaraT:Microvascularprotectionisessentialforsuccessfulneuroprotectioninstroke.JNeurochem(Suppl2):S2-S11,.
4.LiJ,DongY,ChenH,HanH,YuY,WangG,ZengYandXieK:Protectiveeffectsofhydrogen-richsalineinaratmodelofpermanentfocalcerebralischemiaviareducingoxidativestressandinammatorycytokines.BrainRes:-,.
5.MargaillI,PlotkineMandLerouetD:Antioxidantstrategiesinthetreatmentofstroke.FreeRadicBiolMed39:-,5.
6.Gustaw-RothenbergK,KowalczukKandStryjecka-ZimmerM:LipidsperoxidationmarkersinAlzheimersdiseaseandvasculardementia.GeriatrGerontolInt10:-,.
7.VaniJR,MohammadiMT,ForoshaniMSandJafariM:Polyhydroxylatedfullerenenanoparticlesattenuatebraininfarctionandoxidativestressinratmodelofischemicstroke.EXCLIJ15:-,.
8.ApakI,IltumurK,TamamYandKayaN:SerumcardiactroponinTlevelsasanindicatorofmyocardialinjuryinischemicandhemorrhagicstrokepatients.TohokuJExpMed:93-,5.
9.NourM,ScalzoFandLiebeskindDS:Ischemia-reperfusioninjuryinstroke.IntervNeurol1:-,.
10.ZhàoH,LiuY,ZengJ,LiD,ZhangWandHuangY:Troxerutinandcerebroproteinhydrolysateinjectionprotectsneurovascularunitsfromoxygen-glucosedeprivationandreoxygenation-inducedinjuryinvitro.EvidBasedComplementAlternatMed:,.
11.PanatNA,MauryaDK,GhaskadbiSSandSandurSK:Troxerutin,aplantavonoid,protectscellsagainstoxidativestressinducedcelldeaththroughradicalscavengingmechanism.FoodChem:32-45,.
12.BayerNB,SchubertU,SentürkZ,RudloffS,FrankS,HausmannH,GeyerH,GeyerR,PreissnerKTandGaluskaSP:Artificialandnaturalsialicacidprecursorsinfluencetheangiogeniccapacityofhumanumbilicalveinendothelialcells.Molecules18:-,.
13.ChiodelliP,UrbinatiC,MitolaS,TanghettiEandRusnatiM:Sialicacidassociatedwithαvβ3integrinmediatesHIV-1Tatproteininteractionandendothelialcellproangiogenicactivation.JBiolChem:56-66,.
14.ScatenaMandGiachelliC:Thealpha(v)beta3integrin,NF-kappaB,osteoprotegerinendothelialcellsurvivalpathway.Potentialroleinangiogenesis.TrendsCardiovascMed12:83-88,2.
15.MahabeleshwarGH,FengW,PhillipsDRandByzovaTV:Integrinsignalingiscriticalforpathologicalangiogenesis.JExpMed:-7,6.
16.LiangKS,YinCB,PengLJ,ZhangJL,GuoX,LiangSY,ZhouXY,YuanDC,LiGL,HuFY,etal:Effectoftroxerutinandcerebroproteinhydrolysateinjectionforthetreatmentofacutecerebralinfarction:Amulti-centerrandomized,single-blindandplacebo-controlledstudy.IntJClinExpMed10:-,.
17.WangZ:Acontrolled,multi-center,randomizedstudyofefficacyandsafetyoftroxerutinandcerebroproteinhydrolysateinjectionfortraumaticbraininjury.ChinJNeurosurg33:-,(InChinese).
18.YangC,ZhangX,FanHandLiuY:CurcuminupregulatestranscriptionfactorNrf2,HO-1expressionandprotectsratbrainsagainstfocalischemia.BrainRes:-,9.
19.GengX,SyCA,KwiecienTD,JiX,PengC,RastogiR,CaiL,DuH,BroganD,SinghS,etal:Reducedcerebralmonocarboxylatetransportersandlactatelevelsbyethanolandnormobaricoxygentherapyinseveretransientandpermanentischemicstroke.BrainRes:65-75,.
20.HuaK,ShengX,LiTT,WangLN,ZhangYH,HuangZJandJiH:Theedaravoneand3-n-butylphthalidering-openingderivative10beffectivelyattenuatescerebralischemiainjuryinrats.ActaPharmacolSin36:-,.
21.DengWS,XuQ,LiuYE,JiangCH,ZhouHandGuL:Effectsofmelatoninonliverfunctionandlipidperoxidationinaratmodelofhepaticischemia/reperfusioninjury.ExpTherMed11:-,.
22.XuaP,ZhangWB,CaiXH,QiuPY,HaoMHandLuDD:ActivatingAKTtoinhibitJNKbytroxerutinantagonizesradiation-inducedPTENactivation.EurJPharmacol:66-74,.
23.LiP,ShenM,GaoF,WuJ,ZhangJ,TengFandZhangC:AnantagomirtoMicroRNA-b-5pamelioratescerebralischemiaandreperfusioninjuryinratsviainhibitingapoptosisandoxidativestress.MolNeurobiol54:-,.
24.LengT,ShiY,XiongZGandSunD:Proton-sensitivecationchannelsandionexchangersinischemicbraininjury:Newtherapeutictargetsforstroke?ProgNeurobiol:-,.
25.ZhangJ,DengZ,LiaoJ,SongC,LiangC,XueH,WangL,ZhangKandYanG:LeptinattenuatescerebralischemiainjurythroughthepromotionofenergymetabolismviathePI3K/Aktpathway.JCerebBloodFlowMetab33:-,.
26.AlexandrovaMLandBochevPG:Oxidativestressduringthechronicphaseafterstroke.FreeRadicBiolMed39:-,5.
27.FiruziO,MiriR,TavakkoliMandSasoL:Antioxidanttherapy:Currentstatusandfutureprospects.CurrMedChem18:-,.
28.WangR,LiuYY,LiuXY,JiaSW,ZhaoJ,CuiDandWangL:Resveratrolprotectsneuronsandthemyocardiumbyreducingoxidativestressandamelioratingmitochondriadamageinacerebralischemiaratmodel.CellPhysiolBiochem34:-,.、
29.BadalzadehR,LayeghzadehN,AlihemmatiAandMohammadiM:Benefcialeffectoftroxerutinondiabetes-inducedvasculardamagesinrataorta:Histopathologicalalterationsandantioxidationmechanism.IntJEndocrinolMetab13:e,
30.ZhangZG.andChoppM:Neurorestorativetherapiesforstroke:Underlyingmechanismsandtranslationtotheclinic.LancetNeurol8:-,9.
31.KitlinskaJ,AbeK,KuoL,PonsJ,YuM,LiL,TilanJ,EverhartL,LeeEW,ZukowskaZandToretskyJA:DifferentialeffectsofneuropeptideYonthegrowthandvascularizationofneuralcrest-derivedtumors.CancerRes65:-,5.
32.HielscherA,EllisK,QiuC,PorterfieldJandGerechtS:Fibronectindepositionparticipatesinextracellularmatrixassemblyandvascularmorphogenesis.PLoSOne11:e,.
33.SalehiA,ZhangJHandObenausA:Responseofthecerebralvasculaturefollowingtraumaticbraininjury.JCerebBloodFlowMetab37:-,.
预览时标签不可点收录于话题#个上一篇下一篇