年，YvonneBaumer等人在《NatureCommunications》期刊上发表了题为“Hyperlipidemia-inducedcholesterolcrystalproductionbyendothelialcellspromotesatherogenesis”的研究论文。
01
研究背景
动脉粥样硬化的特征：脉管内膜区域增厚。尽管该病的病因很复杂，但普遍认为内皮的改变要早于动脉粥样硬化，其特征是脂蛋白颗粒在内皮下空间内的积累，从而导致保护性内皮单层的扰动[1]。EC吸收的LDL通过细胞转运并沉积在内膜中[2]。在此过程中，一些脂蛋白颗粒被氧化修饰，从而导致上层EC活化，随后选择素和粘附分子的表达吸引单核细胞到达该区域[3]。但是，脂蛋白转移到EC基底外侧的比例很小，其中多少被EC自身代谢仍然是个谜。
最近的研究表明，胆固醇晶体（CC）可能是动脉粥样硬化发病机理中的重要驱动力。关于斑块中CC的生物学效应的研究主要集中于巨噬细胞泡沫细胞的贡献，因为人们普遍认为CC起源于坏死核心中富含胆固醇的细胞[4]。还显示在某些情况下，CC可以通过巨噬细胞中胆固醇的主动细胞内加工而形成[5,6]。尽管尚未发现导致CC形成的确切机制，但温度、pH值、胆固醇水合和饱和度等各种因素都可能在CC形成中发挥作用[7]。针状晶体被认为尤其具有破坏性，可以刺穿内皮以削弱斑块，甚至在晚期的易损斑块中引起血栓形成[8,9]。尚未探讨EC产生CC，特别是在疾病的早期阶段。
02
研究思路
作者用LDL诱导HAoEC，HDF喂养LDL-/-小鼠短时间内内皮下CC的产生和沉积；接着表明CC对内皮功能的损伤，以及F/R（cAMP增强剂）逆转了损伤；但由于F/R的副作用，采用含有F/R的sLex-脂质体靶向发炎的内皮细胞减少体内的动脉粥样硬化斑块形成和CC含量。最后指出：CC在内皮下存在代表动脉粥样硬化发病机理中的一个新颖而重要的特征。
03
研究内容
1.HAoEC在LDL处理后会生成CC
为了确定高胆固醇血症状态下EC是否能够摄取和代谢LDL，作者体外培养人主动脉内皮细胞（HAoEC），并用DiI标记的LDL（图1a）或未标记的天然LDL（图1b，c），持续0、1、3或5天。共聚焦图像显示在第5天，细胞显示出强烈LDL摄取的迹象，可见明显的脂质滴（图1a）。TEM表明细胞内和EC单层基底外侧均存在CC。相反，未经处理的HAoEC保留在紧密连接的融合单层中，几乎没有LD或裂痕（图1b）。PLM观察到一些似乎呈针状的晶体，而未处理的细胞则未显示出晶体的存在（图1c，d）。这些体外结果表明：（1）HAoEC能够强大地吸收LDL，（2）EC在高脂血症条件下产生CC，这暗示了EC介导的CC形成在动脉粥样硬化形成的早期阶段可能发挥作用。
图1
2.CC形成发生在早期的动脉粥化中
为了确定斑块中CC出现的时期，作者用PLM分析HFD喂养的LDL-/-的小鼠的主动脉根切片（图2a），发现仅仅喂养1周，巨噬细胞浸润或新内膜形成的之前斑块中就出现CC，且随着HFD处理时间的延长，CC含量增加。对照主动脉的表面光滑，有一层连续的紧密连接的EC（图2b）。然而，仅在HFD1周后，内皮层显示出来自基础胆固醇沉积物的突出突起（图2d）。此外，TEM切片也显示一致的结果（图2c，e）。
图2
3.胆固醇代谢改变影响CC形成
接下来，作者为了确定胆固醇的储存形式，即胆固醇酯（CE）和游离胆固醇（FC）对EC中CC的影响。使用胆固醇酯转移酶（ACAT）抑制剂CI-和胆固醇酯水解酶抑制剂DEUP处理HAoEC单，发现CI-确实提高了FC水平，DEUP提高了CE水平（图3a-c）。偏光显微镜分析显示，CI-处理后，较大的板状晶体增加，而DEUP处理导致针状晶体的丰度增加（图3d）。用DiI-LDL处理HAoEC发现各组之间的LDL吸收量相似，尽管在DEUP处理的细胞中观察到更多的针状CC（白色箭头），而较大的DiI阴性空间（黄色箭头）（图3e）。SEM图像也显示：LDL处理5天后，体外HAoEC的胆固醇晶体的生成，其中CI-处理导致的主要为板状，而DEUP处理导致的主要为针状CC（图3f）。
图3
4.CC对内皮功能的影响
接下来，作者在体外研究了内皮下CC对内皮功能的影响。当EC形成CC时，细胞不再健康，不能用于进一步的实验，因此，将EC培养在含有CC的明胶中。VE-cadherin和claudin5染色中断（红色）和肌动蛋白应力纤维（绿色）形成表明内皮连接形成受损（图4a）。与对照细胞相比，内皮下CC导致通透性增加2.5倍，完整性降低30%（图4a-d）。使用ECIS损伤系统评估的内皮再生也受到影响（图4e）。当内皮下CC存在时，我们观察到THP-1和Jurkat细胞的迁移分别增加了大约3倍和2倍（图4f,g）。这些数据表明，早期内皮下CC沉积导致内皮完整性受损，并可能促进白细胞的迁移和随后的聚集，白细胞被认为是促进动脉粥样硬化的因素。此外，CC导致RhoA活性升高，Rac1活性下降，而Cdc42和RAS活性未受影响。
图4
5.F/R可减轻CC介导的内皮功能障碍
作者接着探索了减少CC介导的内皮屏障失稳的方法。先前的研究表明F/R：Forskolin（腺苷酸环化酶激活剂）/Rolipram（磷酸二酯酶PDE4抑制剂），可以增强内皮屏障。经F/R处理后，内皮层细胞间形成间隙被消除（图5a），出现了耐药性的差异（图5b,c），还导致RhoA降低和rac1活性升高（图5d,e），这是内皮完整性改善的另一个迹象。此外，F/R治疗逆转了CC诱导的单核细胞和T细胞跨内皮细胞迁移的增加（图5f,g），减少脂质负荷和CC的沉积（图5h,i）。
图5
6.F/R减少体内内皮下CC沉积
作者进一步评价F/R处理在体内的作用。接受F/R治疗的小鼠主动脉窦斑块的CC负荷显著降低（图6a，b）。扫描电镜和透射电镜照片也显示内皮细胞表面更光滑，内皮下间隙中CC沉积较少（图6c，d）。
图6
7.在体内靶向F/R递送至发炎的内皮
尽管F/R有效减少CC的形成，但小鼠注射F/R会导致动物严重疲劳，可能是由于血压的急剧下降所致。作者进一步采用脂质体靶向药物递送系统，专门针对发炎的内皮细胞。首先验证体外条件下脂质体与HAoEC结合的特异性，在未TNFα治疗的情况下，60%的HAoEC呈DiI阳性，经TNFα治疗后，这一比例增至80%，而使用非靶向脂质体的分别为25%和30%（图7a）。其次，进一步探究了脂质体在体内的摄取情况，用HFD喂养ApoE?/?小鼠一周或者在死亡24h前腹腔注射TNFα诱发炎症，所有组尾静脉注射靶向脂质体或非靶向脂质体，激光扫描共聚焦显示主动脉弓内表面的DII-脂质体摄取面积（图7b），表明这种创新的药物传递系统可以用来特异性地对炎症的内皮细胞进行F/R给药。
图7
作者进一步测试了含有F/R的靶向脂质体治疗在减轻动脉粥样硬化负担方面的有效性，ApoE?/?小鼠分为三组：（A）PBS组，（B）PBS填充的靶向脂质体，（C）尾静脉注射F/R填充的靶向脂质体，每周一次，同时喂食高脂饮食6周。整个主动脉的动脉粥样硬化斑块面积的分析显示，使用PBS-脂质体治疗不影响动脉粥样硬化的发展，而使用F/R-脂质体治疗的动物与对照小鼠相比动脉粥样硬化的负担显著降低（图7c）。主动脉根部切片的分析证实，只有使用F/R-脂质体治疗的小鼠的动脉粥样硬化斑块发展显著减少（图7d,e）。此外，F/R-脂质体处理组小鼠的巨噬细胞含量减少，平滑肌细胞含量增加（图7f，g）。重要的是，F/R-脂质体治疗导致斑块中CC含量显著降低（图7h,i）。
04
研究结论
LDL诱导使HAoEC产生CC，HFD喂养Ldlr-/-小鼠仅1周（在巨噬细胞浸润之前），CC在内皮下形成并沉积。
使用sLex的F/R结合脂质体将特定药物递送至发炎的内皮细胞的方法，解决药物的全身应用导致不良副作用，并清楚地证明了该应用减少了体内动脉粥样硬化的发展。
doi:10./s---z.
参考文献：
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THEEND
来源：健康食品脂质创新团队
撰稿：杜润峰博士研究生
编辑：李盼盼硕士研究生
校稿：尹世鹏博士
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